论著免疫抑制小鼠急性重症肺部感染中巨噬

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目的?探讨免疫抑制状态下重症肺部感染小鼠肺巨噬细胞亚型变化情况，观察乌司他丁（UTI）干预的巨噬细胞调控效应，初步明确其拮抗重症肺部炎症的作用机制。

方法?选取60只Balb/c小鼠，分为对照组、模型组和乌司他丁组，每组20只小鼠；其中模型组采用腹腔注射甲泼尼龙（30mg/kg），气管内滴注内毒素（10mg/kg）制备免疫低下急性重症肺部感染小鼠模型；乌司他丁组则在建模前后腹腔注射乌司他丁（1×U/kg）干预；主要观察小鼠呼吸情况、肺泡灌洗液炎性细胞构成、肺组织病理改变与评分以及M1和M2巨噬细胞等指标，采用免疫组化法检测肺组织M2巨噬细胞的CD表达，采用实时定量PCR检测肺泡灌洗液细胞中M1巨噬细胞分泌分子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）和M2巨噬细胞标志与分泌分子CD、Arg-1、IL-10的mRNA表达水平。

结果?模型组和乌司他丁组小鼠一般情况较差，部分小鼠出现呼吸窘迫现象，其中模型组小鼠肺泡腔与间质炎性细胞浸润，肺间质增宽，乌司他丁组病变减轻，与模型组相比，肺损伤评分显著降低〔（肺损伤评分（分）：6.77±0.85比8.21±0.92，P＜0.05〕，乌司他丁组与模型组肺泡灌洗液中中性粒细胞比例显著增高，但两组差异不大。除iNOS外，M1和M2巨噬细胞相关分子均高于对照组，与模型组相比，乌司他丁组M1巨噬细胞相关分子TNF-α、IL-6以及M2巨噬细胞相关分子IL-10、CD均显著降低〔TNF（2-ΔΔCt）：0.42±0.18比0.76±0.12，IL-6（2-ΔΔCt）：0.72±0.26比1.22±0.32，IL-10（2-ΔΔCt）：3.91±1.35比6.84±2.13，CD（2-ΔΔCt）：0.61±0.91比0.92±0.31，均P＜0.05〕，而iNOS和Arg-1则与模型组无显著差别。此外，免疫组化染色检测乌司他丁组肺组织M2巨噬细胞的CD表达，其结果明显低于模型组〔CD（A）值：.0±.97比.0±.5，P＜0.05〕，但高于对照组。

结论?在辅助T细胞Th1单向偏移Th2免疫抑制状态中，重症肺部感染的巨噬细胞呈M1偏向M2亚群优势活化的状态，乌司他丁则可能通过调控M1与M2亚群再平衡来发挥其抗炎效应。

?免疫抑制；?小鼠；?重症肺部感染；?巨噬细胞；?UTI

?基金项目：桂科自GXNSFAA，桂科自GXNSFAA，广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻-8），广西壮族自治区卫生与计生委员会课题（Z）

肺部重症感染是免疫抑制器官移植患者致命的并发症，起病急且发展快，往往在病原体尚未查清时，病情已经极度恶化甚至死亡，是目前临床治疗的难点［1］。肺部重症感染脏器衰竭的病理生理学机制是严重急性过度炎症损伤，研究表明，近年来乌司他丁可通过调节脓毒血症时内皮细胞功能，从而起到抗炎和炎症免疫调理的作用［2-5］，因此广州军区器官移植中心尝试采用大剂量乌司他丁开展临床治疗，发现可延缓肺部重症感染的病程，疗效较好。由于器官移植患者感染前出现辅助T细胞1（Th1）偏向Th2特点的免疫抑制状态［6］，与细菌移位等引起脓毒血症的机体免疫条件不同，因此，有必要进一步明确其免疫抑制肺部过度炎症发生以及乌司他丁抗炎效应的机制，为后续研究与治疗提供思路和依据。此外，肺部巨噬细胞在肺部重症感染发生过度炎症的机制中充当重要角色，而且M1和M2巨噬细胞亚群能够参与炎症反应的不同阶段，与Th1与Th2细胞调控密切相关［7］。鉴于此，本研究在甲泼尼龙免疫抑制小鼠模型的基础上，联合气管内滴注内毒素，制备免疫抑制小鼠急性重症肺部感染，观察其巨噬细胞亚群构成与活性，并进一步施加乌司他丁实验性干预治疗，观察乌司他丁干预后巨噬细胞的调控效应，初步明确其拮抗重症肺部炎症的作用机制。

1?材料与方法

1.1?材料

1.1.1?实验动物：Balb/c小鼠由广西医科大学动物中心提供，许可证号（SCXK桂-），无特定病原体（SPF）级，4～6W，体重为20～25g。

1.1.2?主要试剂：脂多糖（LPS，美国Sigma公司）、甲泼尼龙（美国辉瑞公司）、乌司他丁（UTI，广东天普生化医药株式会社），引物合成、RNA提取、反转录与PCR试剂盒（日本Takara公司，其中PrimeScript?RTreagentKitwithgDNACode：DRRS，SYBR?PremixExTaqTMⅡ（TliRNaseHPlus，Takara公司Code：DRRS）；抗小鼠CD单克隆抗体（北京中杉公司）。

1.1.3?模型建立与实验分组：选取60只Balb/c小鼠随机分为3组，分别为免疫抑制肺部重症感染组（模型组）、乌司他丁组和对照组。具体如下：①模型组（n＝20）：先按文献［2］建立免疫抑制状态小鼠，以30mg/kg剂量腹腔注射甲泼尼龙，连续注射3天；第4天以10mg/kg剂量气管滴注脂多糖（LPS）；②乌司他丁组（n＝20）：在免疫抑制肺部重症感染建模的第4天，气管滴注LPS前、后30min分别给予腹腔注射高剂量（1×U/kg）和低剂量（5×U/kg）的乌司他丁；③对照组（n＝20）：腹腔注射等量生理盐水。取材时点为LPS作用后6小时。

1.2?一般情况观察：记录小鼠的一般体征，精神状态，呼吸频率等。

1.3?支气管肺泡灌洗液细胞的收集方法：麻醉小鼠后用18G留置针气管穿刺固定，用冷RPMI培养液注射器反复冲洗后回收支气管肺泡灌洗液。细胞悬液以r/min转速离心10min，移弃上清液，用细胞沉淀进行后续指标的检测。

1.4?支气管肺泡灌洗液细胞分类检测：细胞沉淀用于涂片，进行瑞氏染色，在油镜下进行细胞分类和计数。

1.5?肺组织苏木精-伊红（HE）染色与肺损伤评分：肺组织HE染色后，进行Smith评分，按肺组织水肿、肺泡间质炎症、肺泡及间质渗出、出血，肺不张和透明膜形成分别进行0～4分的半定量分析。

1.6?肺组织CD免疫组织化学染色：按即用型免疫组织化学试剂盒方法进行检测，免疫组织化学染色结果判断标准：阳性染色为细胞质呈黄褐色，在倍镜下对每张切片随机选择4个视野，采图并用Image-ProPlusVersion6.0图像分析系统进行分析，检测其吸光度（A）值大小。

1.7?定量PCR检测：支气管肺泡灌洗液细胞微量提取RNA、反转录和定量PCR反应均按Takara公司试剂盒方法进行，产物定量计算按参考文献方法进行分析［5］。

1.8?统计学方法：用SPSS17.0进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用F检验，方差齐时采用LSD检验；方差不齐时采用DunnettT3检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2?结?果

2.1?一般情况：模型组与乌司他丁组小鼠均出现精神萎靡，部分小鼠呼吸窘迫，口鼻有淡红色分泌物。

2.2?各组支气管肺泡灌洗液细胞分类与构成比例（图1）：在模型组与乌司他丁组的支气管肺泡灌洗液细胞数量均较对照组增多，主要为单核/巨噬细胞和中性粒细胞，可见少量淋巴细胞，其中乌司他丁组的单核/巨噬细胞比例稍高，而模型组中性粒细胞稍高，但两组无显著统计学差异；对照组主要为单核/巨噬细胞，中性粒细胞与少量淋巴细胞。2.3?各组肺组织病理变化与肺损伤评分（图2）：模型组小鼠肺损伤主要为肺间质肺泡腔大量中性粒细胞，巨噬细胞侵润，肺间质增厚，可见水肿、充血。乌司他丁组小鼠肺损伤减轻，肺损伤评分显著低于模型组（P＜0.05），但两组评分均显著高于对照组。

2.4?各组小鼠肺组织中细胞CD的表达情况（图3）：CD阳性表达于细胞膜，呈黄褐色，模型组和乌司他丁组中CD阳性表达（A值）均显著高于对照组，而乌司他丁组则显著低于模型组（P＜0.05）。

2.5?BALF中M1巨噬细胞相关分子诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达水平（图4）：模型组与乌司他丁组小鼠BALF中M1巨噬细胞相关分子IL-6和TNF-α的mRNA水平在LPS刺激后均显著高于对照组，乌司他丁组IL-6和TNF-α的mRNA表达水平则显著低于模型组（P＜0.05），但各组的iNOS水平无显著差异。

2.6?BALF中M2巨噬细胞相关分子IL-10、Arg-1和CD的mRNA表达水平（图5）：模型组与乌司他丁组小鼠BALF中M2巨噬细胞相关分子IL-10、Arg-1和CD的mRNA表达水平在LPS刺激后均显著高于对照组，模型组与乌司他丁组Arg-1的mRNA表达水平无显著差异；而乌司他丁组IL-10和CD的mRNA表达水平显著低于模型组。

3?讨?论

??器官移植患者是一类典型的免疫抑制状态人群，以环孢素A、强的松、FK等为代表的免疫抑制剂作用靶点多为T细胞，尤其是强的松等激素类药物重点抑制Th1细胞，是引发器官移植患者早期重症机会性感染的机体方面因素。本中心早期研究发现，以大剂量甲泼尼龙（30mg/kg）连续干预小鼠并静脉注射内毒素，发现免疫抑制内毒素血症小鼠细胞免疫的特点是Th1向Th2细胞单向偏移，即Th1相关细胞因子γ-干扰素（INF-γ）、IL-2依然为低水平，而Th2相关细胞因子IL-4、IL-10表达水平均升高，与临床合并脓毒症的肝移植患者免疫状态的变化特点类似［3，6］。在此基础上，本研究在连续使用甲泼尼龙干预后气管滴入内毒素，模拟器官移植患者肺部重症感染，结果发现巨噬细胞M1和M2亚群均处于不同程度的活化状态，其中M1巨噬细胞相关分子TNF-α与IL-6mRNA表达水平显著升高，但iNOS变化不大；而巨噬细胞M2亚群则表现为多个相关分子的高水平表达，如CD、IL-10和Arg-1等高水平表达，进一步做肺组织的M2亚群细胞标志CD免疫组化检测，发现肺间质中出现大量CD阳性细胞，提示此时M2巨噬细胞处于全面活化亢进状态。究其原因，可认为Th1细胞偏向Th2细胞的免疫抑制特点有利于出现M2巨噬细胞极化状态亚群，可能与Th2细胞因子IL-4与IL-10占优势密切相关，其中IL-4可诱发巨噬细胞选择性激活，诱导分化为M2巨噬细胞亚群［7-8］。本研究中由于Th1细胞活性被甲泼尼龙抑制，即使在强烈刺激剂LPS诱导下也不能充分激活而分泌INF-γ，导致巨噬细胞群体向M1极化减弱，所以M1亚群相关分子水平并未全面升高。大剂量甲泼尼龙还可抑制LPS活化自然杀伤（NK）细胞，减少INF-γ的另一个主要来源［9］。因此，根据巨噬细胞群体细胞因子和标志特点，本研究免疫抑制小鼠急性重症感染肺部的巨噬细胞亚群偏向M2型。根据单核-巨噬细胞极化理论，单核细胞在组织转化为巨噬细胞具有高度异质性，M1和M2亚群是两个极端状态，因此，巨噬细胞可位于极端分化M1/M2之间的任一中间阶段［7］。虽然选择性激活M2型巨噬细胞的活性增强，但杀菌能力可能并未提高，有研究发现M2型巨噬细胞氨酸酶表达升高，通过消耗精氨酸含量而减少一氧化氮合成底物，使一氧化氮合成减少而减弱杀菌能力［10］；也可能是本研究中M1亚群iNOS活化减弱的诱导因素，也提示M1和M2亚群可能有互相调控的可能性。动物实验和器官移植患者临床观察表明，重症肺部感染时，强的松龙等免疫抑制剂营造的机体Th2和肺部M2优势极化状态结局非常不佳，前期实验就发现模型动物的存活时间基本不超过24h，多在12h时死亡，病死率在90%以上，而临床患者病程进展迅速，可导致器官移植患者死亡。因为机体处于Th2与M2的优势状态可能是一个代偿性抗炎症反应综合征（CARS）状况，导致预后不佳。因此，有必要尝试改变此时肺部和机体的免疫状态以缓解重症肺部感染。为防止排斥反应，器官移植患者不允许长期停用免疫抑制以和彻底改变H1抑制的状况，因此，其主导策略与普通的脓毒血症不同，即在抗炎的同时不能充分提高细胞免疫而抗感染。此外，停用免疫抑制也增加了排斥反应的风险。

??乌司他丁是广谱蛋白水解酶抑制剂，近几年多用于脓毒血症的抗炎治疗，阻断全身炎症反应综合征（SIRS），减少肺损伤，缓解呼吸衰竭病程发展［11］通常联合使用胸腺肽等药物提高T细胞活性，增强机体抗感免疫，获得更满意的临床效果［12-13］。本中心在移植后肺部重症感染时，给予大剂量使用乌司他丁干预，可缓解病情加重，另外为防止肺纤维化的发生，仍维持一定剂量的皮质激素治疗，并未完全撤出激素干预，提示有必要进一步探讨乌司他丁的抗炎机制。因此，针对器官移植重症肺部感染患者，是否考虑在免疫反应起始环节的巨噬细胞就进行调控，使过度炎症反应通过巨噬细胞亚群调控而获得缓解，如M1和M2亚群再平衡的调控，可不涉及Th1和Th2的调节，从而达到抗炎效果。本研究中的动物实验发现，乌司他丁组小鼠肺部炎性细胞侵润减少，肺损伤的评分减少，提示乌司他丁对免疫低下的重症肺损伤的小鼠肺组织具有保护作用。进一步分析发现，乌司他丁在抑制巨噬细胞活化方面显示了良好的调控效应，降低了M1巨噬细胞亚群分泌的细胞因子，如TNF-α、IL-6，体现其抗炎效应，还可以显著抑制M2巨噬细胞分泌IL-10，减少其分子标志CD和CD，但对Arg-1的改变不大，尤其是回调过高的IL-10，是改善CARS的一个因素，因为IL-10水平并不是越高越有利［14］，这说明乌司他丁的抗炎作用更多表现为M1和M2细胞亚群失衡的调控作用，可能使LPS活化的M1和M2以及中间段的巨噬细胞细胞亚群回调至机体可控的炎症范围，维持一定水平的M1和M2再平衡，但又可适应Th1单向偏移Th2的免疫抑制状态，可减轻甚至避免“炎症细胞因子风暴”对肺部的损伤。这可能作为器官移植肺部重症感染的抗炎治疗模式与机制研究的全新切入点。

参考文献：略。

?欢迎阅读转载，转载请注明文章来源：《实用器官移植电子杂志》，，4（1）：46-51.

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